一、前言：
香椿(Toona sinensis Roem.; Cedrela sinensis A. Juss.)為楝科(Meliaceae)多年生落葉大喬木，樹幹直立，小枝皮孔小而顯著，髓心粗而圓；嫩芽有毛，全株具特異臭氣；葉具長柄、互生、偶數羽狀複葉，小葉具短小葉柄，7~9對、卵形披針形或披針狀長橢圓形，先端銳尖，基部近於圓形，疏細鋸齒緣，有時近於全緣，長9~18公分，寬3~5公分，裡面淡綠色，側脈9~11對；葉柄紅色，基部粗肥，上有淺溝。小葉10~22枚，具香氣。
在高雄醫學大學許勝光教授研究香椿的生理功效發現，由體外癌細胞實驗我們已知可對多種(肺癌：A549、H226，直腸癌：Colo205，骨癌：U-2 OS，肝癌：Hep G2，卵巢癌：SKOV3、PA-1，乳癌：MCF-7)人類癌細胞有抑制生長之作用，甚至啟動癌細胞凋亡（apoptosis）的機制，更重要是對癌細胞株有很強毒殺作用的濃度下，對於正常細胞並無傷害，如毒殺分析(MTT)試驗中不影響肺臟的正常細胞(MRC-5)生長。
香椿是藥食兼用的食材，全樹可利用，是經濟價值極高之樹種，亞蔬中心營養系代主任楊瑞玉研究百餘種蔬菜的抗氧化性，發現香椿排名第一，抗癌的效果比目前火紅的地瓜葉高三到十倍。因此對於香椿具有除熱、解毒、止血、殺蟲、治腸炎等藥效，以及近期發現本植物具有抗癌與降血糖之活性，顯示香椿表現出多元化的保健功效，是藥食兼用的食材，值得進一步對此類食材，繼續進行香椿各部位的保健功效評估及其有效活性成分分離與鑑定，並據以建立指標性成分評估方法。
而高醫團隊初步篩選發現香椿對多種癌細胞株生長皆有抑制作用，甚至啟動癌細胞自殺的機制，更重要的是對癌細胞株有很強毒殺作用的濃度下，對於正常細胞並無傷害，開發成保健食品極具潛力，對其有效劃分或成分之研究分析實為刻不容緩，需要團隊的密切合作，才能達到事半功倍之效果。因香椿葉部製備的粗萃物(TSL-1)含有大量抗氧化的植物多酚成份，在團隊抗癌篩選下初步顯示其為主要抗癌活性來源，因此配合高效儀器等作進一步分離，儘可能分離與鑑定出其他有效活性成分，純化出來的各種天然化合物，以各種光譜儀分析，配合判讀各項光譜，並完成建立有效部分（Fractions）之HPLC指紋圖，與未來可供驗證的有效指標成分分析方法，或找尋更好的抗癌活性化合物的替代來源。
二、材料與方法：植物成分與活性之研究：
本研究以香樁幼嫩葉經以水煮後得到粗萃物經冷凍乾燥後成粉（TSL），再以不同比例酒精處理所得溶解性不同之各劃分(Fractions)進行分離，此程序獲得的劃分我們將利用種種柱層與儀器，配合研究團隊抗癌生物活性篩選，分離出具有活性之劃分或化合物，純化後並以各種光譜技術與配合各種衍生物之製備，決定化合物之結構，或提供其他研究進行本食材經再加工程序與貯存後，對保健功效成分之影響與變化的依據。（香椿葉萃取法）：將香椿幼嫩葉加水煮沸30分鐘後，以濾網過濾後取出香椿葉，將萃取液以3000rpm、12min、4℃離心處理後，上清液及沉澱物分別以冷凍乾燥法得到粉狀(固體狀)物，分別稱為TSL-1及TSL-1P等。
分離流程先以TSL-1等劃分，分別採開放式大型矽膠（silica gel，Si gel 60，Merck，230-400 mesh）柱層層析分離，進一步細分可分別利用正相或逆相矽膠柱層層析（normal or reverse phase silica gel）、矽酸柱層層析（silicic acid）、分子篩柱層層析（sephadex LH-20）、活性碳等層析材料作為固定相，並配合HPLC(高效液相層析儀)等作細部分離，盡可能分離出各種成分。
構造研究：純化出來的各種天然化合物，以各種光譜儀分析，配合判讀各項光譜MASS、UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、COSY、HETCOR、NOESY、HMBC等，各純化合物之測定，融點(Melting point)，以融點器測定。旋光度(Optical rotation)，以數位旋光儀測定。
生物活性篩選-肺癌細胞毒殺效應：將分離獲得的劃分或是純化合物送與高醫相關團隊進行肺癌細胞毒殺活性篩選。
三、結果：
1. 由TSL-1粗萃物（99克），進行活性劃分之分離工作，按極性大小共分成18個細劃分，並逐步進入細分的階段，部分細劃分分離獲得一些活性物質，經鑑定出本劃分(TSL-1)主要含有活性物質Gallic acid、Methyl gallate、Ethyl gallate、Kaempferol、Kaempferol-3-O-β-D-glucoside、Quercetin、Quercetin-3-O-β-D-glucoside、Quercitrin、Rutin及Catechin等，並配合團隊肺癌細胞NSCLC（Human non-small-cell lung cancer cells (H520、H661、H441)）毒殺活性進行篩選，並建立起香椿TSL-1劃分的指標性成分HPLC圖譜。抗癌活性篩選結果也顯示香椿葉部甲醇粗萃物與TSL-1同具有明顯毒殺NSCLC的作用(P<0.01)。其中TSL-1的Gallic acid含量，經採HPLC定量與已知濃度比較後，平均含量約10 %~13%。
2. 細胞毒殺活性篩選，顯示以不同萃取流程得到的香椿劃分，加入24小時後對NSCLC的毒殺效應結果。而我們也進行香椿各部位的粗萃物對NSCLC的毒殺效應的比較，結果顯示葉部甲醇粗萃物與TSL-1同具有明顯毒殺NSCLC的作用(P<0.01)。
3. 為進一步了解香椿本劃分(TSL-1)抗癌活性來源，將香椿TSL-1逐次經乙酸乙酯、正丁醇萃取後和最後水層的濃縮物，進行比較各部份NSCLC細胞毒殺效果，結果則顯示毒殺效果大部存在於乙酸乙酯和正丁醇層中，此部份含有已分離的酚類化合物為主，而水層則幾乎沒有毒殺效果。
4. 已提供此部份分離獲得的活性物質，與團隊進行相關後續研究測試，如抗癌、止痛、安全評估等。也進行嘗試製備相關抗癌活性測試較佳的結構修飾，進一歩了解結構與活性的關係。目前已測試Gallic acid等與Gallic acid相似結構的化合物對NSCLC的毒殺效應，目前由結構-活性相關探討結果暫推估，結構中的-COOH基團似乎與癌化細胞辨認位置有某種程度相關，可區分正常與癌化細胞，而結構中的-OH基團則扮演毒殺效應，但相關結果還需更多資料來證明。
5. 部分分離獲得的化合物及有活性劃分，已提供相關團隊進行後續實驗，包含高醫大、成大、中國醫大、東華、義守等相關研究單位，本研究未來一~二年預計將有2~3篇相關報告陸續發表刊登國際期刊。
6. 本研究申請國內、國外的專利皆已獲通過，其餘部分成果也將陸續進行專利申請中。
四、討論：
1. 由香樁幼嫩葉以水煮後得到粗萃物經冷凍乾燥後成粉（TSL），再經以不同比例酒精處理所得溶解性不同之各劃分(TSL-1、TSL-2、TSL-2P、TSL-3P、TSL-4、TSL-4P)進行細胞毒殺活性篩選，結果顯示以不同香椿劃分加入24小時後對NSCLC的毒殺效應，以TSL-1及TSL-2的效果最佳，因此推測香椿抗癌活性物其極性應屬酒精可溶性。進一步分析香椿各部位的甲醇粗萃物（葉、莖、皮、材、根）與TSL-1比較，結果顯示香椿葉部甲醇粗萃物與TSL-1同具有明顯毒殺NSCLC的作用(P<0.01)，且毒殺作用以葉部甲醇粗萃物較TSL-1為強，對BEAS-2B的毒殺能力也比較大，這可能是兩者萃取用的溶劑與製備方式的不同所造成。經水煮製備酒精抽提的TSL-1，降低對正常BEAS-2B的細胞毒殺效果，卻仍保有明顯毒殺NSCLC的作用。
2. 本研究香椿TSL-1粗萃物的活性物質分析，是以矽膠層析管柱做進一步細部分離，並配合生物活性試驗(Bioassay)，作為研究導向指標，再以各種層析方式(Chromatography)，進一步分離活性成分。目前分離出Gallic acid、Methyl gallate、Ethyl gallate、Kaempferol、Kaempferol-3-O-β-D-glucoside、Quercetin、Quercetin-3-O-β-D-glucoside、Quercitrin、Rutin及Catechin等化合物，所有分離得到的化合物結構由比對文獻光譜資料(IR、NMR與Mass)解析鑑定出來，本結果雖無新化合物的發現，但由其中分離獲得主量化合物Gallic acid約佔TSL-1總重10~13 %，並提供與合作團隊進行生物活性分析，確定為香椿生理活性指標成分之一，因此香椿這些含量豐富的植物酚類化合物，似乎為抗癌活性的重要來源。
3. 已分離獲得化合物Gallic acid、Methyl gallate、Ethyl gallate、Rutin、Quercitrin和Quercetin，已先進行標準品的HPLC指紋圖譜，可做為指標追蹤使用。再進一步分析香椿葉部與TSL-1的HPLC指紋圖譜，結果可看出香椿葉部Methyl gallate及黃酮類Quercetin、Rutin含量較多。TSL-1則以Gallic acid為主，黃酮類次之。因此香椿葉部水煮製備經酒精抽提獲得的TSL-1，降低對正常BEAS-2B的細胞毒殺效果，卻仍保有明顯毒殺NSCLC的作用，似乎與製備過程中Methyl gallate或其他植物酚類化合物轉換成Gallic acid，加強了癌細胞毒殺作用，及黃酮類被保留下來強化保護正常細胞有關，值得做進一步了解與釐清。
4. 針對NSCLC的毒殺效應濃度實際上還可再降低，因為根據其他團隊不同癌細胞（卵巢癌、子宮頸癌、口腔癌、肝癌與乳癌等）採用的毒殺濃度結果，遠低於測試濃度甚多。TSL-1的Gallic acid之含量，若採HPLC定量與已知濃度比較後計算，平均含量約10 %~13%。
五、結論與建議：
1. 本研究配合團隊的抗癌活性篩選，完成香椿TSL-1的主量活性成分的分離與鑑定，本劃分活性物質Gallic acid、Methyl gallate、Ethyl gallate、Kaempferol、Kaempferol-3-O-β-D-glucoside、Quercetin、Quercetin-3-O-β-D-glucoside、Quercitrin、Rutin及Catechin。也建立起香椿各部及TSL-1等活性劃分的指標性成分HPLC圖譜。另進行比較非酚類化合物部分之NSCLC細胞毒殺效果，結果顯示毒殺效果大部存在於乙酸乙酯和正丁醇層中。
2. 香椿葉及TSL-1含有多量抗氧化成分的多酚類化合物，非其他來源可如此輕易供給，除已提供此部份分離獲得的活性物質，與團隊進行相關後續研究測試，包含癌細胞毒殺、抗氧化實驗、安全性評估等數批，應可達成相當的研發成果。
3. 本研究雖只進行兩年，但本團隊對香椿的研發已完成開發保健食品的目的，除積極將研發成果技術移轉給相關民間公司，也將在學術期刊陸續發表結果，國內外專利的通過也驗證創新的成果，可惜的是未能繼續大動物體或人體內活性及安全性測試，確認香椿對人體保健功效，到達保健食品開發的最終目的地。
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資料來源：“繼往開來-台灣之椿”, 香椿鄉村研發俱樂部, 2007, ISBN:978-986-83607-0-9
