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2009.09.06中醫補強課程講義二(分子生物實驗方法專論)

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生物實驗方法專論
Techniques in Molecular Biology

洪堂耀     博士

大仁科技大學 生物科技系

http://mail.tajen.edu.tw/~tyhong/

Email: tyhong@mail.tajen.edu.tw

200996

Ø      課程大綱

*      分子選殖技術

*      限制酶

*      載體

*      選殖基因的確認

*      基因庫的製作

*      蛋白質純化原理

*      離子交換管柱層析

*      膠體過濾管柱層析

*      斥水性交互作用管柱層析

*      親合性管柱層析

分子選殖程技術(DNA重組技術)材料
遺傳工程技術

標的DNA

+

限制酶(restriction enzyme)

+

接合酶(ligase)

+

載體(vector)

轉形(transformation)至宿主(細菌)

染色體DNA的抽取、載體的抽取

引子設計、PCR標的基因(基因分析)

限制酶切割PCR標的基因與載體

接合PCR標的基因與載體

藍白篩選或選殖基因的確認(抽取質體以限制酶切割,確認插入DNA的大小)

重組基因之表現

重組蛋白之純化

SDS-PAGE分析重組蛋白

 

分子選殖實驗方法聖經

 

3rd Edition 2001

2nd Edition 1989

1st Edition 1982             






 

Ø      Chapter 1.  Plasmids and Their Usefulness in Molecular Cloning

Ø      Chapter 2.  Bacteriophage lambda and Its Vectors

Ø      Chapter 3.  Working with Bacteriophage M13 Vectors

Ø      Chapter 4.  Working with High-capacity Vectors

Ø      Chapter 5.  Gel Electrophoresis of DNA and Pulsed-field Agarose Gel Electrophoresis

Ø      Chapter 6.  Preparation and Analysis of Eukaryotic Genomic DNA

Ø      Chapter 7.  Extraction, Purification, and Analysis of mRNA from Eukaryotic Cells

Ø      Chapter 8.  In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction

Ø      Chapter 9.  Preparation of Radiolabeled DNA and RNA Probes

Ø      Chapter 10. Working with Synthetic Oligonucleotide Probes

Ø      Chapter 11. Preparation of cDNA Libraries and Gene Identification

Ø      Chapter 12. DNA Sequencing

Ø      Chapter 13. Mutagenesis

Ø      Chapter 14. Screening Expression Libraries

Ø      Chapter 15. Expression of Cloned Genes in Escherichia coli

Ø      Chapter 16. Introducing Cloned Genes into Cultured Mammalian Cells

Ø      Chapter 17. Analysis of Gene Expression in Cultured Mammalian Cells

Ø      Chapter 18. Protein Interaction Technologies











Ø      載體(vector)

*      攜帶基因進入細菌體的物質

*      可在細菌複製與繁殖

*      細菌的質體(plasmid)與噬菌體(bacteriophage)

Ø      宿主生物

*      最常用為細菌

*      細菌的質體易從細胞中分離,也容易進入細胞

*      生長快速

*      缺點:與真核生物轉錄與轉譯有些差別

*      後轉譯修飾-加上醣基或脂質

Ø      質體(Plasmid)

*      復製原ori:才能在細菌中大量複製

*      耐抗生素基因:以利選殖出帶有此質體的細菌株

*      選殖位置(mutiple cloning sites)供選殖基因接入位置。

*      相同複製原的質體屬世同個不親和群體

*      當細菌中已經先有了某種質體,種製原和它相同的質體就不能再進入

*      複製原來源不同的質體,可以同時存在同一個細菌中


 






























 


 

Ø      限制酶restriction enzyme

*      原核生物所產生

*      保護原核生物免於外來DNA感染

*      1970 Johns Hopkins Hamiton Smith所分離

*      辨識DNA上特定的核苷酸序列

*      雙股DNA 4-8個核苷酸

*      雙股序列相同,方向相反, 稱迴文序列palindromic sequence

*      命名法:Hind III Haemophilus infuenzae

*      第一個字母細菌的屬名genus

*      第二、三字母細菌的種名species

*      第四個字母細菌的strain

*      羅馬數字為發現的順序

*      限制酶因切割位置不一樣有三種缺口

 

*      切出5’端突出的黏端5’-cohesive (sticky end)

 

 



*      切出3’端突出的黏端3’-cohesive (Sac I)





*      切出鈍端blunt-end






Ø      勝任細胞competent cells

*      進行基因選殖時,不可能利用自然發生的接合現象來完成細菌轉型的步驟

*      改變細菌的細胞壁,增加細胞膜的通透性,讓質體很容易進入,這種細胞稱為勝任細胞(competent cell)

*      CaCl2化學處理

*      便宜簡單的常用方法,並不因為方法老舊而被淘汰

*      電穿孔(electroporation) 方式

*      瞬間電流增加細胞膜孔洞提高DNA轉型效率

 

Ø      細菌品系的選擇

*      製作勝任細胞必須要選用正處生長 旺盛期的健康細菌

*      現在大量被用來作實驗的細菌大部分是大腸桿菌,僅品系不一樣strain

*      防止細菌發生基因重組或突變




DNA重組成功的篩選方法-菌落藍白篩選

*      確認載體成功進入細菌

*      使用抗生素標記

*      確認基因有接入載體

*      lacZ基因被插壞





乳糖操作組




確定DNA重組成功的方法

 

*      LacZ基因可產生半乳糖苷酶,分解X-gal生成藍色菌落

*      LacZ基因被外來DNA插壞,不產生半乳糖苷酶,無法分解X-gal,菌落呈白色






 





X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside

X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside



 

基因庫的建立與篩選

原核生物:染色體DNA

 

真核生物:

mRNA

cDNA

質體株(plasmid clones)

基因體庫(genomic library)

專一性分子探針(molecular probe)

 



 

mRNA的純化步驟













cDNA製作










基因庫中的序列片段為隨機,需要多少DNA片段才能涵蓋整個基因組?

*      篩到基因的機率(細菌)

    公式:N = ln (1 -P) / ln (1 –F/T)

*      N 所需篩選的重組clone數目

*      P 篩到基因的期望值 (0.99)

*      F 單一個重組DNA的平均片段大小 (5 kb)

*      T 基因組大小 (460萬 bp = 4600 kb)

 

N = ln (1-0.99) / ln (1 – 5/4600)

         = ln 0.01 / ln 0.998913

    = -4.6 / - 0.0010879 = 4234

Ø      真核生物的基因組比較複雜,不適合上述公式的計算基礎

*      基因組中具有exon, intro片段

*      所抽取當時細胞表達的基因之mRNA站所有基因的百分比

*      mRNA反轉錄成cDNA的效率

蛋白質

Ø      蛋白質性質

*      胺基酸性質

*       蛋白質組成

*      蛋白質功能

*      生物反應的催化作用、儲存、運輸

*      傳遞訊息、抗體、調控、結構

Ø      蛋白質分離與純化

*      分離與純化流程、樣品備製、蛋白質溶解性

*      蛋白質沈澱、 蛋白質變性、蛋白質電泳分離

*      酵素水解、蛋白質層析 

Ø      蛋白質鑑定

*      蛋白質定序

*      蛋白質基因選殖

*      蛋白質體學

*       MAS 鑑定蛋白質法

*      蛋白質序列與功能分析

Ø      蛋白質結構

*      蛋白質結構介紹、蛋白質結構及功能分析 

*      蛋白質結構決定法: NMR方法、X-ray 繞射方法

*      蛋白質結構模擬、蛋白質晶体學的應用

Ø      蛋白質的純化

*      防止蛋白質變性失去活性

*      大部分於低溫操作(4冷房)

*      pH 4-10之間操作

*      減少泡沫的產生

*      注意重金屬、有機溶劑、微生物污染、

*      蛋白質水解酵素               

*      選擇有效的純化方法

*      純化過程中持續追蹤蛋白質活性

Ø      要純化那一個蛋白質?         What ?

Ø       為何要純化此蛋白質?       Why ?

Ø       由何種材料純化?               Which ?

Ø       由那一個生長期?               When ?

Ø       如何純化此蛋白質?   How ?

*      酵素的純化過程,約可分為三個階段:

*      粗萃取蛋白 (crude extract protein)

    胞外酵素→鹽析沉澱法、濃縮器濃縮

    細胞內酵素→打破細胞(動物、植物、真

    菌、細菌、酵母菌)

*      部分純化 (partially purified)

                    初步的純化,使用各種管柱層析法。

*      均質酵素 (homogeneous)︰

                   目標酵素的進一步精製純化,可用製備式電    泳或 FPLC, HPLC 等。

Ø      純化的方法

*      鹽溶鹽析               最經濟方便的純化

*       膠體過濾法         依照分子大小分離

*       離子交換法         利用分子電荷性質

*       親和層析法         最具專一性的吸著

*       純化策略             善用分子各種特性

 

 

鹽溶 Salting-in :



 

提高鹽濃度會增加蛋白質的溶解度:


 

鹽析 Salting-out :





蛋白質分子表面的疏水性區域,都聚集許多水分子,當鹽類加入時,這些水分子被抽出,以便與鹽離子進行水合,暴露出來的疏水性區域互相結合,形成沈澱。

 

 

有機溶劑沈澱法:



降低水活性,使溶液的介電常數下降,增加蛋白質溶質分子之間的作用力,因而聚集在一起。

 

 

各種純化或分析方法的原理





各種純化方法的應用次序:




 

膠體過濾法的膠體材質



Pharmacia

Sephadex              glucose (dextrose)

Sepharose             agarose

Sephacryl              glucose + acrylamide

Sephacel                cellulose

 

FPLC Superose, Superdex, Mono Q, Mono S

 

Bio-Rad        BioGel P   acrylamide

BioGel A   agarose



















 





 

膠体過濾法的膠球





 

各種離子交換介質:




等電點與環境pH的關係:







 

陰離子交換法  Anion Exchange:




 

陽離子交換法  Cation Exchange:

 





 

各種離子交換介質:




 

等電點與環境pH的關係:


 




 


 

陰離子交換法  Anion Exchange:



 

陽離子交換法  Cation Exchange:






 

 

                                                        1.以NaCl鹽梯度沖提

                                                        2.改變溶液pH值-接近pI

 

 

斥水性交互作用
層析法

Hydrophobic

 Interaction

 Chromatography





 
                                                                                


親和性層析法的作用原理:




 

Ø      Protein Tags

*      His tag

*      Binds Ni-NTA column (Qiagen)

*      Elute with imidazole

*      pET vectors from Novagen carry N- or C-term his tag

*      T7 promoter

*      Many anti-his antibodies available, effectiveness varies

*      Some vectors: thrombin cleavage site

*      GST tagglutathione S-transferase

*      Binds glutathione-sepharose column

*      Elute with reductant

*      Biotin tag

*      Purifies with avidin column

*      Elute with excess biotin or chaotrope (KI)

*      Hard to elute!  Dont recommend if need high yield

*      Intein tag

*      Self cleaving!


 


 








 
















 


 



               1.粗萃取液

               2.陰離子交互層析

               3.斥水性交互作用層析















Ø      Biuret Method︰ 銅離子與蛋白質骨架上的 C=O 基團結合,再還原成銅 (紅橙色)。

Ø      Lowry Method︰ 前半為 Biuret Method,再加上磷鉬酸與磷鎢酸對 Tyr 吸附呈色 (藍色)。

Ø      UV absorbance︰ 蛋白質骨架上 C=O 對 200 nm 波長,芳香族胺基酸對 280 nm 有吸光。

Ø      Bradford Method︰ Coomassie Blue G 吸附到蛋白質後會變成藍色,蛋白質越多,藍色越深。

Ø      Special properties︰ 許多蛋白質含有特殊的金屬 (如 Cd)、基團 (如 heme) 等,都有特定的分析方法。

 

 

各種蛋白質定量法的比較:







Purified protein of Streptomyces b-1,3-glucanase (CT)






 

                              























 






















































 

台長:采庭
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